Sds-polyacrylamidgelelektrophorese
Zwei SDS-Gele nach abgeschlossener Trennung der Proben und Färbung

SDS-PAGE (Abkürzung für engl. sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) ist eine Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese, einer analytischen Methode der Biochemie zur Trennung von Stoffgemischen im elektrischen Feld.

SDS-PAGE wird in der Analyse von Proteinen verwendet. Als Trennmedium bei dieser Art der Elektrophorese dient ein Gel auf Polyacrylamidbasis. Zusätzlich kommt SDS (Natriumdodecylsulfat) zum Einsatz. Dieses anionische Tensid (Detergens) überdeckt die Eigenladungen von Proteinen. Pro 1 g Protein binden ungefähr 1,4 g SDS, sodass die Proteine eine konstante Ladungsverteilung aufweisen.

Bei der Probenvorbereitung wird SDS im Überschuss zu den Proteinen hinzugegeben und die Probe anschließend auf 95 °C erhitzt, um Sekundär- und Tertiärstrukturen durch das Unterbrechen von Wasserstoffbrücken und das Strecken der Moleküle aufzubrechen. Optional können Disulfidbrücken durch Reduktion gespalten werden. Dazu werden reduzierende Thiole wie β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT) oder Dithioerythrit (DTE) dem Probenpuffer zugesetzt. Am Ende dieser Präparation weisen die mit SDS beladenden Proteine eine ellipsoide Form auf. Wegen des starken Denaturierungseffekts können in der Regel keine Proteine mit Quartärstruktur bestimmt werden. Einzig die sogenannten SDS-resistenten Proteinkomplexe sind auch in Gegenwart von SDS (bei Raumtemperatur) stabil. Dieses Phänomen wird als kinetische Stabilität bezeichnet: Um die Komplexe zu denaturieren, ist eine hohe Aktivierungsenergie erforderlich. Obwohl das native, vollständig gefaltete Protein unter den Bedingungen keine ausreichende thermodynamische Stabilität besitzt, kann dieses chemische Gleichgewicht nicht einfach erreicht werden. Kinetisch stabile Proteinkomplexe zeichnen sich neben der SDS-Resistenz auch noch durch Stabilität gegen Proteasen und eine große Halbwertszeit aus.[1]

Zur Auftrennung werden die denaturierten Proben auf ein Gel aus Polyacrylamid geladen, das in geeignete Elektrolyten eingelegt ist. Danach wird eine elektrische Spannung angelegt, die eine Migration der negativ geladenen Proben durch das Gel bewirkt. Das Gel wirkt dabei wie ein Sieb. Kleine Proteine wandern relativ leicht durch die Maschen des Gels, während große Proteine eher zurückgehalten werden und dadurch langsamer durch das Gel wandern. Am Ende des Vorganges sind alle Proteine nach Größe sortiert und können durch weitere Verfahren (Färbungen wie z. B. Coomassiefärbung oder Silberfärbung, Immunologische Nachweise wie z. B. beim Western Blot) sichtbar gemacht werden. Zusätzlich zu den Proben wird meistens ein Größenmarker auf das Gel geladen. Dieser besteht aus Proteinen von bekannter Größe und ermöglicht dadurch die Abschätzung der Größe der Proteine in den eigentlichen Proben.

Als Elektrolyt wird häufig ein SDS-haltiges TRIS-Glycin-Puffersystem eingesetzt, das eine sehr gute Trennung der Proteine ermöglicht. Dieses System wurde von Ulrich Laemmli entwickelt.[2] Aufgrund der – beiläufigen – Beschreibung des Verfahrens ist die Publikation das am häufigsten zitierte Paper eines Einzelautors, und nach dem Artikel von Lowry et al. das zweithäufigst zitierte insgesamt.[3] Zur Trennung von kleinen Proteinen und Peptiden eignet sich besser das TRIS-Tricin-Puffersystem von H. Schägger.[4]

Kommerzielle Gelsysteme (so genannte pre-cast-Gele) verwenden die Puffersubstanz BisTris mit einem pH-Wert von 6,4 sowohl im Sammel- als auch im Trenngel. Diese Gele werden bereits fertig gegossen geliefert und sind umgehend einsatzbereit. Der niedrige pH-Wert verhindert den Zerfall des Polyacrylamids und macht die Gele über längere Zeit lagerfähig. Zusätzlich besitzt dieses Gelsystem einen sehr großen Auftrennungsbereich, der zusätzlich durch Verwendung von MES oder 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure im Laufpuffer variiert werden kann.

Literatur

  1. Manning, M. & Colón, W. (2004): Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. In: Biochemistry. Bd. 43, S. 11248-11254. PMID 15366934
  2. Laemmli, U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. In: Nature. Bd. 227, S. 680-685. PMID 5432063 doi:10.1038/227680a0
  3. www.nzzfolio.ch: Interview mit Ulrich Lämmli. NZZ Folio, 11/2005.
  4. Schägger, H. & von Jagow G. (1987): Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. Bd. 166, S. 368-379. PMID 2449095 doi:10.1016/0003-2697(87)90587-2

Siehe auch

Weblinks


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