RLM-RACE


RLM-RACE

Als RACE-PCR (von engl. rapid amplification of cDNA-ends with polymerase chain reaction) wird in der Molekularbiologie eine Technik zur schnellen Vervielfältigung von cDNA-Enden mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion bezeichnet.

Das Ziel von RACE-PCRs liegt in der Isolation von Gen-Enden und ist eine Abwandlung der RT-PCR.

Inhaltsverzeichnis

Methoden

Mittels RACE lässt sich die Sequenz eines RNA Transkriptes ermitteln, ausgehend von einer kurzen bekannten Sequenz im Transkript zum 5'-Ende (5'-RACE-PCR) oder zum 3'-Ende (3'-RACE-PCR) der RNA.

3'-RACE

Die 3'-RACE ist die einfachere Methode, da man den Startpunkt durch den poly(A)-Schwanz schon hat. Nachteil ist, dass man vor allem den nichtkodierenden 3'-UTR erwischt, da dieser durchschnittlich 770 bp lang ist, und die Taq-Polymerase ab circa 800-1000 bp dazu neigt mit der DNA-Polymerisierung aufzuhören. Moderne (und teurere) Polymerasen schaffen aber auch mehr. Der 5'-UTR ist im Durchschnitt kürzer (etwa 300 bp) und bietet zusätzlich für die Untersuchung der Genregulation interessante Stellen.

Bei der 3'-RACE beginnt man mit einem Oligo(dT), an dessen 5'-Ende ein von der Sequenz bekannter Anker-Primer sich anschließt. Die Oligo(dT)-Sequenz lagert sich an den poly(A)-Schwanz an und dient als Primer für die Reverse Transkription. Danach wird die mRNA durch RNase H degradiert und ein zweiter Primer (in sense-Richtung), der im Geninneren liegt, wird an den neu entstandenen cDNA-Strang angelagert. Danach wird eine PCR mit dem internen sense-Primer und dem Ankerprimer durchgeführt. Das Produkt wird anschließend auf ein Sequenziergel aufgetragen und so die gesuchte Sequenz bestimmt.

5'-RACE

Bei der 5'-RACE wird mit einem internen Primer, der in Gegensinn-Richtung (antisense) gerichtet ist begonnen. Mit diesem wird mit der Reversen Transkriptase der cDNA-Gegenstrang zur mRNA synthetisiert bis zum 5'-Ende der mRNA. Daraufhin wird mit einer terminalen Nukleotidyltransferase und dATP ein eigenes poly(A)-Ende angehängt. Danach wird die mRNA durch RNase H degradiert. An diesen cDNA-poly(dA)-Schwanz wird nun ein Ankerprimer (ein Oligo(dT) mit einem bekannten Primer) angelagert. Daraufhin wird eine PCR mit dem internen antisense-Primer und dem Ankerprimer durchgeführt. Das Produkt wird anschließend auf ein Sequenziergel aufgetragen um die gesuchte Sequenz genau zu bestimmen.

RLM-RACE

Die sogenannte Capfinder-Strategie der RACE (auch RLM-RACE, RNA ligase mediated RACE) dient zur Untersuchung des vollständigen 5'-Endes der cDNA. Bei dieser Methode werden zuerst sämtliche freien 5'-OH-Enden durch eine Alkalische Phosphatase (calf intestine phosphatase, CIP) dephosphoryliert, nur durch capping geschützte mRNAs sind hiervon nicht betroffen. Im zweiten Schritt werden die Caps mit Hilfe einer Nikotinsäure-Pyrophosphatase (tobacco acid pyrophoshatase, TAP) abgespalten, wobei das 5'-α-Phosphat erhalten bleibt. Mit Hilfe der T4-RNA-Ligase wird dann ein RNA-Adapter-Oligonukleotid mit bekannter Sequenz an die mRNA ligiert. Es folgt eine Reverse Transkription und eine PCR mit dem RT-Primer und dem Adapter-Primer am 5'-Ende.

SMART-RACE

Bei der SMART-RACE (switching mechanism at 5' end of RNA transcript) wird die gesamte mRNA von einem Oligo(dT)-Primer aus in cDNA umgeschrieben. An das 3'-Ende der cDNA (entspricht dem 5'-Ende der mRNA) wird ein Oligo(dC) angefügt. Mit Hilfe eines Ankerprimers mit einem passenden Oligo(dG) und einem Oligo(dA)-Ankerprimer für das 3'-Ende wird dann eine PCR durchgeführt. Die Sequenzierung verläuft analog zu den anderen RACE-Methoden.

Literatur

  • Frohman, M. A. (1993): Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE. In: Methods Enzymol. 218: 340-356. PMID 7685466

Siehe auch


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