Gel-Permeations-Chromatographie


Gel-Permeations-Chromatographie

Bei der Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) handelt es sich um eine Art der Flüssigchromatographie ähnlich der HPLC. Die Trennung findet hier jedoch rein aufgrund der Größe (genauer: dem hydrodynamischen Volumen) der Moleküle in Lösung statt. Weitere Bezeichnungen sind Größenausschluss-Chromatographie oder englisch Size Exclusion Chromatography (SEC). Wird mit einem wässrigen Laufmittel gearbeitet, so verwendet man auch häufig den Begriff Gelfiltrations-Chromatographie (GFC). Als stationäre Phase verwendet man in der Regel poröse Polymere in granulärer Form (z. B. Sephadex). Typische Anwendungen sind jegliche Art von Makromolekülen wie die Polymerfraktionierung synthetischer Polymere, Biopolymere (z. B. Polysaccharide) und Proteine. Die GPC ermittelt die Verteilungskurve der Molmasse, womit anschließend die mittleren Molmassen (Mn, Mw, Mz) und die Polydispersität der Probe berechnet werden können. Die verschiedenen Detektionsvarianten (RI-Detektor, UV/VIS, Viskosität, Lichtstreuung, ..) müssen auf den jeweiligen Polymertyp sorgfältig kalibriert werden.

Inhaltsverzeichnis

Aufbau eines GPC-Systems

Aufbau eines GPC Systems (für die Probenreinigung)

Die wesentlichen Bestandteile eines GPC-Systems sind Pumpe, Injektionssystem, Trennsäulen und verschiedene Detektoren. Die Pumpe saugt das Laufmittel an und erzeugt einen konstanten Fluss durch das gesamte System. Häufig wird das Laufmittel durch einen sogenannten Inline-Degasser gesaugt, der gelöste Gase entfernt. Nach der Pumpe steht das Injektionssystem, entweder manuell oder ein Autosampler. Hier findet die Probe Ihren Weg in das System. In den darauf folgenden Trennsäulen wird die Probe aufgrund ihres hydrodynamischen Radius aufgetrennt. Die verschiedenen Detektoren liefern dann je nach Art bestimmte Aussagen. Letztendlich landet der gesamte Fluss (inklusive Probe) in einem Abfallgefäß. Der Fluss (das Eluat) kann aber auch in einzelne Gefäße aufgefangen werden, man spricht dann von Fraktionierung (präparative GPC). Als effektive Methode zur weiteren Aufreinigung von bestimmten GPC-Fraktionen, die z. B. biologisch aktive Metalloproteine enthalten, bietet sich für diese Zwecke die quantitative präparative native kontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese (QPNC-PAGE) an.

Trennprinzip

Trennung in der GPC-Säule

Die Trennsäulen sind mit kleinen Kügelchen eines porösen hochvernetzten Materials (Polymer oder Silikat) gefüllt. Der Durchmesser der Kügelchen liegt im Bereich von ca. 3–35 µm. Die Kügelchen dieses „Gels“, wie das Material oft genannt wird, besitzen eine hochporöse Oberfläche und je nach Molekülgrößen, die getrennt werden sollen, Porengrößen von ca. 60–2000 Å; (6–200 nm). Eluiert wird nun eine Probe mit Molekülen verschiedener Größe. Die kleinen Moleküle diffundieren in die Poren des Gels und verbleiben dort bis sie wieder heraus diffundieren. Größeren Molekülen steht weniger zugängliches Porenvolumen zur Verfügung. Damit eluieren die großen Moleküle zuerst gefolgt von immer kleineren. Jeweils sehr große und sehr kleine Moleküle können nicht getrennt werden. Alle Moleküle, die nicht in die Poren passen eluieren ganz am Anfang und Moleküle, die sehr gut in alle Poren passen, ganz am Ende.

Trennsäulen

GPC Säule

Generell unterscheidet man zwei Typen von Säulen: Die so genannten Single-Porosity-Säulen von den Linear-Säulen, welche auch Mixed-Bed-Säulen genannt werden. Die Single-Porosity-Säulen haben Poren mit einer sehr geringen Porengrößenverteilung. Sie trennen sehr gut in einem bestimmten Größenbereich. Um eine Trennung über einen größeren Molmassenbereich zu erzielen, werden hier häufig 3–4 Trennsäulen mit verschiedenen Porengrößen hintereinander geschaltet. In den Mixed-Bed-Säulen wurde das Säulenmaterial bereits vom Hersteller so abgemischt, dass von sehr kleinen bis großen Poren alle Porengrößen vertreten sind. Diese Säulen trennen über einen großen Molmassenbereich und sehr linear mit dem hydrodynamischen Volumen. Die Trennleistung einer Mixed-Bed-Säule ist daher begrenzt, so dass auch hier für eine gute Auftrennung 2–3 Trennsäulen kombiniert werden. Heutzutage dominieren die Mixed-Bed-Säulen. Die Single-Porosity-Säulen haben aber durchaus ihre Berechtigung für spezielle Anwendungen.

Detektoren

Als Detektoren finden sogenannte Konzentrationsdetektoren wie Brechungsindexdetektoren (RI-Detektor von engl. refractive index) und UV-Detektoren (je nach UV-Aktivität des zu analysierenden Polymers) Verwendung. Bei diesen Detektoren steigt die Peakfläche proportional mit der Konzentration, was eine Quantifizierung einer Substanz ermöglicht. Bei der klassischen GPC wird allein dieser Detektortyp verwendet und die Anlage wird zur Ermittlung der Molekülmassen mit Standardsubstanzen kalibriert.

Unter dem Synonym der molmassensensitiven Detektoren finden weiterhin Viskositätsdetektoren und Lichtstreuungdetektoren Verwendung. Dieser Detektortyp ist nur in Kombination mit Konzentrationsdetektoren verwendbar, weil zur Molmassenberechnung in jedem Fall die Konzentration benötigt wird. Insbesondere die Lichtstreuung kann unabhängig von Polymerstandards die Molekularmassenmittelwerte (Mn, Mw, Mz) und den Gyrationsradius direkt bestimmen. Hierbei unterscheidet man vor allen Dingen Mehrwinkel- (MALS), Kleinwinkel- (LALS) und Rechtwinkel-Lichtstreudetektoren (RALS). Mit dem Viskositätsdetektor können die Parameter K und α der Mark-Houwink-Gleichung, eine universelle Kalibrierung und Aussagen über die Konformation des Polymers gemacht werden.

Zusätzlich finden auch Infrarot-Detektoren und Fluoreszenzdetektoren Anwendung, beschränken sich aber auf spezielle Applikationen.

Konventionelle Kalibrierung

Konventionelle Kalibrierung mit drei Pullulan-Standards unterschiedlicher Größe

Die konventionelle Kalibrierung findet nur beim Einsatz eines Konzentrationsdetektors (RI oder UV) Verwendung. Zur Kalibrierung werden meist mehrere unterschiedlich große Polymerstandards mit niedrigen Polydispersitäten eingesetzt. Aus den angegebenen Molekülmassen der Standards und der nach Analyse erhaltenen Retentionszeit kann man die Kalibrierkurve erstellen. Mit Hilfe der Kalibrierkurve können nun die Molekülmassen unbekannter Proben bestimmt werden. Als Ergebnis erhält man relative Molmassen, bezogen auf die Standardsubstanz. Da nicht für jedes Polymer engverteilte Standards verfügbar sind, kann die Molmassenberechnung bei Verwendung unterschiedlicher Standards problematisch sein. Obwohl man in solchen Fällen möglichst „ähnliche“ Standards verwendet, kann die Molmassenberechnung dramatisch von der realen abweichen. Eine wesentlich sicherere Methode wäre hier der Einsatz einer direkten Methode wie z. B. der Lichtstreuung.

Universelle Kalibrierung

GPC unter Verwendung eines Konzentrationsdetektors (RI oder UV) in Verbindung mit einem Viskositätsdetekor. Zur Kalibrierung werden Polymerstandards mit niedrigen Polydispersitäten eingesetzt und eine Kalibrationskurve Log (Molmasse × Intrinsische Viskosität) aufgestellt. Da das Produkt von (Molmasse × Intrinsische Viskosität) proportional zum hydrodynamischen Radius ist, lassen sich so die realen bzw. absoluten Molmassen berechnen.

Lichtstreudetektion

Durch Einsatz eines Lichtstreudetektors entfällt das Aufstellen einer Kalibrationskurve. Ein Lichtstreudetektor misst indirekt die absolute Molekülmasse. Zur Auswertung ist zusätzlich ein Konzentrationsdetektor notwendig. Die Rayleigh-Gleichung ist die zentrale Gleichung die den Zusammenhang zwischen der gestreuten Lichtintensität, die durch das so genannte Rayleigh-Verhältnis R(θ) ausgedrückt wird, der Polymerkonzentration c und der gewichtsgemittelten Molmasse Mw herstellt. Dabei ist K eine optische Konstante und A2 der zweite Virialkoeffizient.

\frac{Kc}{R(\Theta)}= \frac{1}{M_w P(\Theta)}+2A_2c

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