IEF


IEF

Als Isoelektrische Fokussierung oder kurz IEF wird eine elektrophoretische Auftrennung von Proteinen in einem Gel aufgrund ihres relativen Gehalts an sauren und basischen Aminosäureresten bezeichnet.

Inhaltsverzeichnis

Prinzip

Je nach pH-Wert des sie umgebenden Mediums tragen die basischen und sauren Aminosäuren eines Proteins unterschiedliche Ladungen (sieh Artikel Ampholyte). Am sogenannten isoelektrischen Punkt (pI) eines Proteins beträgt seine Nettoladung, also die Summe aller Ladungen der einzelnen Aminosäuren, null. Bei diesem pH-Wert ist die elektrophoretische Beweglichkeit ebenfalls null.

Durchführung

Ein Proteingemisch wird in ein Trägergel eingebracht (meist Polyacrylamid), in dem zuvor ein pH-Gradient etabliert wurde. Die Etablierung dieses Gradienten erfolgt entweder elektrophoretisch mittels im elektrischen Feld frei beweglicher Trägerampholyte oder über immobilisierte (d.h. kovalent mit dem Trägergel verbundene) Ladungsträger. Anschließend wird an das Gel eine elektrische Spannung angelegt. Jedes Protein bewegt sich nun im elektrischen Feld auf Grund seiner Eigenladung so weit, bis der pH-Wert des Trägergels seinem pI entspricht. Ein Protein, welches aus dieser Gelregion wegdiffundiert, erhält durch die Veränderung des pH-Wertes wieder eine Nettoladung und bewegt sich erneut in den Bereich des Geles, dessen pH-Wert seinem pI entspricht. Das elektrische Feld konzentriert ('fokussiert') somit jedes einzelne Proteine im Gel im pH-Bereich seines spezifischen pI.

Einsatz

Die Technik der isoelektrischen Fokussierung wird zur (analytischen) Bestimmung des pI von Proteinen sowie zur (präparativen) ladungsabhängigen Fraktionierung von Proteingemischen eingesetzt. Durch die Einführung immobilisierter pH-Gradienten hat sich die Reproduzierbarkeit einzelner Fokussierungsläufe deutlich verbessert. Dies war die Voraussetzung für die Entwicklung leistungsfähiger Proteinanalyseverfahren wie der 2D-Gelelektrophorese. Die IEF dient hier der elektrophoretischen Proteinauftrennung in der ersten Dimension.

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