QPNC-PAGE

QPNC-PAGE (Abkürzung für engl.: quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis) ist eine spezielle Variante der Gelelektrophorese, einer analytischen Methode der Biochemie und Bioanorganischen Chemie zur Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld. Dieses hochauflösende Verfahren dient zur quantitativen Abtrennung und Isolierung von Metalloproteinen aus menschlichen, pflanzlichen oder tierischen Proben und leistet dadurch einen wichtigen Beitrag zur Strukturaufklärung von nativen und denaturierten Proteinen in komplexen Proteingemischen.

Elektrophoresepuffer und Gel

Elektrophoresezelle für die präparative PAGE

Als kontinuierlicher Elektrophoresepuffer wird bei QPNC-PAGE eine spezielle Pufferlösung, eine Mischung aus 20 mM Tris-HCl und 1 mM NaN₃, mit dem pH-Wert 10,00 gewählt. Kontinuierlich bedeutet in diesem Zusammenhang, dass sowohl der Anodenpuffer, als auch der Kathodenpuffer sowie der Puffer zur Herstellung des Polyacrylamid-Gels die gleiche chemische Zusammensetzung und Konzentration haben. Die meisten Proteine eines lebenden Organismus sind bei dem pH-Wert von 10,00 negativ geladen und wandern im elektrischen Feld daher von der Kathode zur Anode.

Das Polyacrylamid-Gel muss auf Grund der technischen Vorgaben der verwendeten Elektrophoresekammer vor jedem Lauf frisch hergestellt werden (siehe Abbildung "Elektrophoresezelle"). Die Herstellung erfolgt prinzipiell so, wie es bereits in dem Artikel Polyacrylamid-Gelelektrophorese beschrieben ist. Die Parameter des Gels werden in der zitierten Literatur dargelegt.

Das Gel benötigt insgesamt 69 Stunden zur vollständigen Polymerisation bei Raumtemperatur. Dieses Vorgehen bewirkt, dass sich keine freien Monomere mehr im Gel befinden, wodurch Reaktionen von Gelkomponenten mit den zu isolierenden Analyten ausgeschlossen werden können. Das Gel ist mechanisch stabil und lässt sich gut handhaben. Die Polymerisationsdauer des Gels hat Bedeutung für die Reproduzierbarkeit der Elutionszeiten von Metalloproteinen im Elektropherogramm (siehe Abbildung "Elektropherogramm").

Trenneigenschaften und Quantifizierung

Elektropherogramm einer präparativen nativen Polyacrylamid-Gelektrophorese von Metalloproteinen

Die Eigenschaften des standardisierten Verfahrens der QPNC-PAGE bewirken, dass bei einem elektrophoretischen Lauf weder die Größen (Molekülmassen) noch die Formen (Gestalt) der zu isolierenden Proteine eine Trennung beeinflussen. Stattdessen erfolgt die Isolierung der aufgetrennten Proteine (Metalloproteine, Proteine mit organischen Cofaktoren und ohne Cofaktoren) und Peptide ausschließlich entsprechend den isoelektrischen Punkten (pI).

Die aufgetrennten Moleküle wandern jeweils mit unterschiedlich konstanter Geschwindigkeit als ringförmige Proteinbanden durch das Gel (siehe Abbildung "Elektrophoresezelle") und werden dann kontinuierlich von einem physiologischen Puffer (pH 8,00) reproduzierbar eluiert (siehe Abbildung "Elektropherogramm"). Bei einer Trennung werden weder die vorliegenden Metall-Proteinkomplexe dissoziiert noch die nativen Konformationen verändert. Das Auflösungsvermögen der QPNC-PAGE für Metallcofaktoren (z.B. Fe, Cu, Zn, Ni, Mo, Pd, Co, Mn, Pt, Cr oder Cd), bewegt sich im physiologisch wirksamen Bereich von ungefähr 1 ng/mL.

Molekularsiebeffekte oder sonstige Interaktionen der Gelmatrix mit den Analyten können auf Grund der Porengröße und Homogenität des Gels als vernachlässigbar gering eingestuft werden. Nach einer Identifizierung und absoluten Quantifizierung der Metallcofaktoren mit der ICP-MS (Abkürzung für engl.: inductively coupled plasma mass spectrometry) kann ein isoliertes Metallprotein aufgrund seiner hohen Reinheit und optimierten Konzentration der NMR-Spektroskopie zugeführt werden.

Einsatzgebiete

Arzneipflanze ‎"Ginkgo biloba". Ginkgo-Extrakte werden u.a. zur frühen Behandlung von Demenzerkrankungen eingesetzt. Ginkgoblätter enthalten biologisch aktive Kupferchaperonproteine, die möglicherweise Bedeutung für die ursächliche Behandlung der Alzheimer-Krankheit haben

Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie können ein- oder mehrdimensionale Proteinstrukturen in bestimmten PAGE-Fraktionen von nativen und denaturierten Metall-Proteinen aufgeklärt und mit Hilfe der Bioinformatik Struktur-Funktionsbeziehungen für bestimmte Metalloproteine (z.B. Metallochaperone, Prionen, Metalloenzyme, u.a.) ermittelt werden. Besonders wichtig ist dieser Ansatz für die klinische Diagnostik und Therapie im Bereich von Krankheiten, deren Ursprung eine Fehlfaltung der Proteine ist, wozu beispielsweise Alzheimersche Krankheit, Parkinson-Krankheit, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und verschiedene Krebserkrankungen zählen. Besondere Bedeutung für die Entwicklung neuer Medikamente für bestimmte Fehlfaltungskrankheiten haben mittlerweile Heilpflanzen und Nutzpflanzen erlangt. Im industriellen Maßstab werden zu diesem Zweck pharmakologisch wirksame rekombinante Proteine (Molecular Pharming) oder andere biologisch aktive Pflanzeninhaltsstoffe erzeugt, deren Wirkung im Organismus ("Relative biochemical impact") mit Hilfe einer Strategie bestehend aus analytischen, biochemischen und biophysikalischen Verfahren nachgewiesen werden kann.

Literatur

• N. Fitri, B. Kastenholz, B. Buchari, M.B. Amran, F.M. Warganegara: Molybdenum speciation in raw phloem sap of castor bean. In: Anal. Lett. 41, 2008, S. 1773–1784.
• B. Kastenholz, D.E. Garfin: Medicinal plants: a natural chaperones source for treating neurological disorders. In: Protein Pept. Lett. 16, 2009, S. 116-120.

• B. Kastenholz: Important contributions of a new quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (QPNC-PAGE) procedure for elucidating metal cofactor metabolisms in protein-misfolding diseases – a theory. In: Protein Pept. Lett. 13, 2006, S. 503-508.

Weblinks

• Kastenholz, Bernd and Garfin, David E. Isolation of Acidic, Basic and Neutral Metalloproteins by QPNC-PAGE. Nature Precedings (engl.)